МЕТОДЫ

Список методов

Забор периферической крови для последующего анализа.

Цель: выделение лимфоцитов из крови.
Принцип разделения клеток крови в градиенте плотности основан на различиях в величине их плавучей плотности. При центрифугировании в градиентном растворе клетки крови перемещаются в пробирке до тех пор, пока не достигнут области градиента, где их плавучая плотность равна плотности среды. Для разделения лимфоидных клеток человека используют градиент плотности, равный 1,077 г/см3. При этом плавучая плотность мононуклеаров и лимфоцитов меньше, чем таковая величина используемого градиента, поэтому данные клетки располагаются над градиентом. Гранулоциты и эритроциты, имеющие большую плавучую плотность, в процессе седиментации проходят через градиентный раствор и опускаются на дно пробирки.

Цель: отделение популяции T-reg клеток.
С помощью проточного цитрометра можно отделять популяции клеток по их фенотипу. Для T-reg характерным фенотипом является СD4+СD25+Fохр3+, по которому их можно выделить среди остальных лимфоцитов.
Типы клеток и их маркёры

Цель: получение транскриптома T-reg.
TRI Reagent ® сочетает в себе фенол, тиоцианат и гуанидин (в одной фазе) для ингибирования РНКазы. Последующее добавление бромхлорпропана или хлороформа приводит к разделению раствора на водную и органическую фазы. РНК переходит в водную фазу, ДНК - в интерфазу, а белки - в органическую фазу. Затем РНК может быть осаждена из водной фазы с добавлением изопропанола.

Цель: получение данных об относительной экспрессии FOXP3.
Использование РНК-зависимой-ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы) позволяет получить кДНК для проведения ПЦР. В специальный буфер (с ионами магния для нормальной работы полимеразы) с перенесенным в него транскриптомом добавляются dNTP, праймеры (NCBI primer blast), ДНК-полимераза (удобна Taq-полимераза), TaqMan (зонд) или иной краситель. Во время проведения ПЦР прибор считывает флюоресценцию от красителей и строит график зависимости флюоресценции от времени, по которому можно определеть количество амплифицированных кДНК. Важно делать ПЦР как для мРНК FOXP3, так и для мРНК того, что есть в клетке всегда и не зависит ни от чего (ген домашнего хозяйства). К примеру, можно посчитать экспрессию FOXP3 относительно β-актина.

Цель: анализ полученной информации.
Анализ будет проводиться на языке программирования Python с использованием таких модулей как Pandas, Matplotlib и Seaborn. Возможно применение методов снижение размозмерности данных PCA или tSNE или методов машинного обучения, но для этого сначала нужно увидеть данные.